1.鹽析法(飽和硫酸銨沉淀法)
該純化方法是基于在待純化免疫血清中加入飽和硫酸銨溶液,由于抗體也是一種蛋白質(zhì),其在水溶液中的溶解度是由其本身攜帶的親水基團(tuán)數(shù)和電荷數(shù)決定的,當(dāng)我們向抗血清中加入飽和硫酸銨溶液后,硫酸根離子和銨根離子與抗體競(jìng)爭(zhēng)溶液中的水分子,因?yàn)榱蛩岣x子和銨根離子與抗體分子相比,具有更強(qiáng)的親水性,因此抗體分子表面的水化膜被破壞,同時(shí)其暴露出來(lái)的帶電基團(tuán)被溶液中的鹽離子所中和進(jìn)而導(dǎo)致其溶解度大大降低,依據(jù)此原理從而將其從抗血清中分離。
2.正辛酸-飽和硫酸銨沉淀法
該純化方法原理是:正辛酸在偏酸條件下,能與抗血清中或者小鼠腹水中的雜蛋白結(jié)合,在等電點(diǎn)附近將其沉淀,IgG類抗體則存在于上清液中,再利用飽和硫酸銨沉淀法即可進(jìn)一步提純。
3.Protein A和protein G純化法
基本原理:protein A和proteiin G 可以和抗體IgG分子的Fc段特異性結(jié)合。Protein A和proteinG 作為配基可以被偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠上,當(dāng)抗血清從中流過(guò)時(shí),特異性的IgG就與配基結(jié)合,其他雜蛋白則穿流而過(guò)。因兩種蛋白純化抗體時(shí)對(duì)不同宿主的抗體的結(jié)合能力不同,我們需要具體情況具體對(duì)待,分別選擇protein A 或者protein G,或者是protein A/protein G組合。一般推薦小鼠單抗IgG2a,IgG2b,IgG3,兔,人,豬的多克隆抗體用protein A純化,而小鼠單抗IgG1, 大鼠單抗,小鼠,大鼠,山羊的多克隆抗體則選擇用protein G純化。
4.免疫親和純化法
基本原理:將抗原作為一種配基偶聯(lián)在sepharose 4B上,血清等生物液體中的特異性抗體與sepharose 4B上的抗原進(jìn)行特異性結(jié)合,其他雜蛋白和雜抗體則不被結(jié)合,通過(guò)洗滌和洗脫等一系列實(shí)驗(yàn)步驟即可得到高純度的目標(biāo)抗體。本方法雖然和Protein A/G均被稱為親和純化方法,但是純化得到的最終的抗體還是有很大區(qū)別的,ProteinA/G純化得到的主要是非特異性的IgG類抗體,而本方法純化得到的主要是特異性的IgG類抗體,與其他純化方法相比,本方法純化得到的抗體其特異性好,純度最高。本純化方法的實(shí)驗(yàn)步驟與protein A/G純化方法基本一致,將實(shí)驗(yàn)方法三的配基protein A/G換成相應(yīng)的目標(biāo)抗原即可。
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