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大腸桿菌菌體蛋白殘留（E.coli DH-5α）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定血清，血漿及相關液體樣本中大腸桿菌菌體蛋白殘留（E.coli DH-5α）的含量。

實驗原理：

   本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大腸桿菌菌體蛋白殘留（E.coli DH-5α）水平。用純化的大腸桿菌菌體蛋白殘留（E.coli DH-5α）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入大腸桿菌菌體蛋白殘留（E.coli DH-5α），再與HRP標記的大腸桿菌菌體蛋白殘留（E.coli DH-5α）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大腸桿菌菌體蛋白殘留（E.coli DH-5α）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大腸桿菌菌體蛋白殘留（E.coli DH-5α）濃度。

試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上   清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。

2. 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分   鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中   如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/   分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃   度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右  （2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?  用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將   標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢   測，其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進   行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

  1.標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在、第二孔中分別加標準品    100μl，然后在、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從孔、第二孔中各取    100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后    在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、    第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第    七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分    別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九    第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為18ng/L，12ng/L ，    6ng/L，3ng/L， 1.5ng/L）。

  2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品               孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品    終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

  3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

  4.配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。

  5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5    次，拍干。

  6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

  7.溫育：操作同3。

  8.洗滌：操作同5。

  9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分    鐘. 

 10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

 11.測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后    15分鐘以內(nèi)進行。

注意事項：

  1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用     完，板條應裝入密封袋中保存。

      2.濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

  3.各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制      在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

  4.請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大標        準品孔孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請      后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

  5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

  6.底物請避光保存。

  7.嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

  8.所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

  9.本試劑不同批號組分不得混用。

  10.如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，    

在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD      

值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋      

倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標      

準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值      

代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋      

倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。                  

        （此圖僅供參考）

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.95以上。

2.批內(nèi)與批間應分別小于9%和11%

檢測范圍：                                            

0.7ng/L -20ng/L                                                                   

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6個月